왜 Gene Cloning 입니까

 

 

출처

http://biochemistry.yonsei.ac.kr/sub/catalog.php?CatNo=13

 

 

 

왜 Gene Cloning 입니까

분자생물학에는 많은 실험기법과 분야가 있지만 gene cloning이 가장 중요하고 모든 실험의 기본이 됩니다. Gene cloning은 모든 고급 테크닉의 시발점이 되는 실험이기 때문입니다. Gene clonig으로 DNA 를 자르고 붙이고 변형시켜서 실험에 필요한 재조합 DNA(recombinant DNA)를 제조하고 Southern, Northern, cell culture 실험 등에서 사용해야 할 생체 내 유전자를 얻을 수 있을 뿐 아니라 기본적인 효소의 처리와 DNA의 분리 및 조작방법을 배울 수 있습니다.

Gene Cloning 이란 무엇입니까

Clone이란 identical하다는 뜻입니다. 예를 들면

  - Cell clone은 identical한 cell의 집합
  - Bacterial clone은 같은 형질의 세균들 집합
  - Human clone은 복제인간
  - Gene clone은 동일한 유전자의 집합

 

 

 

위의 그림에서와 같이 한 cell에서 배양하여 가득 채운 cell들은 모두 identical하다는 전제하에 실험을 하게 됩니다. 세포배양의 기술에 따라서 오래 배양하면 조금씩 세포의 성질이 변하기도 하지만, clone이라는 개념은 여기에서 출발하였습니다.

 

Bacteria도 마찬가지입니다. 한 마리의 bacteria를 배양해서 얻은 균 용액은 모두 같은 bacteria의 형질을 가지고 있다고 볼 수 있습니다.

 

최근에 나오는 복제인간도 이런 개념으로 이해하여 영어로 cloned human이란 용어를 사용하게 된 것 같습니다. 하지만, 위에서 설명한 세포나 bacteria에 비하면 사람은 복제인간을 만들어도 똑같은 형질을 나타낼 지는 의문이기 때문에 조금 다른 개념으로 이해해야 할 것 같습니다. 즉 사람의 경우는 genotype은 같겠지만 phenotype에 대해서는 같아질 지 아직 모릅니다.

이런 개념을 유전자에 응용한 것이 바로 gene clone의 개념입니다. 세포 실험을 하기 위해서는 동일한 세포의 집합이 필요하듯이, 유전자 연구를 하기 위해서는 동일한 유전자를 다량 가지고 있어야 합니다. 이렇게 동일한 유전자의 집합을 만드는 과정이 바로 gene cloning입니다. 위의 그림과 같이 insulin 유전자를 포함한 DNA를 100% 동일한 집합으로 얻어내면 insulin gene을 cloning한 것이 됩니다. 이 유전자로 많은 실험을 할 수 있겠지요.

 

여기에서 다룰 내용은 아니지만, 한 가지 설명을 더 하도록 하겠습니다.

만약 어떤 단백질의 존재를 알고 있다고 해 봅시다. 우리가 단백질은 알고 있지만 그 단백질을 만드는 유전자를 아직 모른다고 한다면, 이 유전자가 어떤 염기서열로 되어 있는지, 그리고 유전자의 구조가 어떻게 되어있는지 밝혀야 합니다. 이럴 때 단백질을 만드는 유전자를 알아낸다면, 예를 들어 어떤 단백질의 cDNA나 genomic DNA의 염기서열을 알아내었다면, 우리는 그 단백질의 유전자를 cloning했다고 이야기합니다. 이런 때 사용하는 cloning의 개념은 단백질의 유전자를 알아내기 위해서 gene cloning의 방법을 사용하기 때문에 나오는 것입니다. 논문을 볼 때 "Cloning of human XX protein and functional characterization..." 등등의 제목으로 나오는 것들은 이런 개념으로 이해하여야겠습니다.

 

Gene cloning의 과정

Gene cloning의 개념을 이해하셨겠지만, 때로는 이런 개념보다는 gene cloning의 과정이 다음과 같은 4가지 과정으로 이루어진다는 것을 알면 더욱 쉽게 이해할 수 있습니다. 이러한 과정은 이 노트를 읽어가면서 이해할 수 있게 될 것입니다.

 

  1. 유전자를 설정하고 그 유전자를 얻어낸다
  2. 얻은 유전자를 vector에 삽입한다
  3. 유전자가 삽입된 vector(recombinant DNA)를 bacteria 세포 내로 주입한다
  4. Bacteria 중에서 올바르게 만들어진 clone을 확인하고 선택한다

 

 

 

이 그림에서는 잘 알려진 p53 유전자를 cervix cancer cell로부터 얻어내는 과정을 나타냈습니다. 얻고자 하는 유전자를 어떤 방법으로든 얻어내고 이 DNA 조각을 vector에 삽입하고 bacteria로 주입합니다. 그런데, 이렇게 삽입하는 과정에서 원하는 bacteria 뿐만 아니라 DNA가 안들어간 것, 잘못된 DNA가 들어간 것 등등 여러 가지 가능성이 생기기 때문에 gene cloning의 마지막 과정은 이 중에서 올바른 clone을 찾아내는 과정이 됩니다.

 

 

>>가설과 실험 디자인

 

그러면 gene cloning의 각 단계를 어떻게 진행하는지에 대한 자세한 설명을 하겠습니다. 하지만, 그전에 실험 디자인을 해 보도록 합시다. 그냥 아무 유전자나 cloning한다고 하면 재미도 없고 잘 이해가 되지 않기 때문에, 많은 사람들이 기본으로 생각하는 한 가지 실험 디자인을 예로 삼아서 강의를 진행하겠습니다.

 

정상세포와 암세포의 차이

 

 

 

이미 잘 알고 계시리라 생각합니다만, 암세포는 정상 세포에 비하여 다음과 같은 세가지 측면에서 현저한 차이를 보인다고 합니다.

 

- indefinite cell growth

- invasion

- metastasis

 

이런 성질을 통털어서 그냥 abnormal cell behavior를 보이는 것이 암세포의 큰 특징이라고 합시다.

이런 성질을 이용하여 암 치료 전략을 세우는 것이지요. 정상세포는 건드리지 않고 암세포만 죽이려면 우선 정상세포와 암 세포의 차이를 알아내는 것이 중요하니까요.

 

Abnormal cell behavior라는 것은

 

암세포가 비정상적인 cell behavior를 보이는 이유는 무엇일까요? 한마디로 말해서 그건 세포의 행동을 결정하는 세포 내 단백질의 차이에서 기원한다고 할 수 있습니다.

즉, 암세포는 정상세포와 비교할 때 비정상적인 단백질이 있거나 정상적인 단백질이 없다는 말이 됩니다. (물론 존재 자체의 문제가 아니라 기능의 문제일 수도 있습니다.)

 

 

Central dogma

 

그런데, 그런 단백질들은 세포에서 어떻게 만들어지나요? 분자생물학의 시발점이라고도 할 수 있는 central dogma에 의하면 유전 정보의 흐름은 대략 DNA에서 mRNA로, 그 다음 단백질로 내려오는 것입니다. 그러므로 위에서 말한 비정상적인 단백질이 있거나 정상적인 단백질이 없다는 말은 곧 비정상적인 유전자가 있거나 정상적인 유전자가 없다는 말이 되지요. (물론 여기에서도 존재의 문제가 아닌 기능의 문제일 수도 있음을 분명히 해야겠지요.)

 

 

 

p53이란 단백질이란

 

그래서, 이런 기본적인 관찰로부터 하나의 가설을 세우도록 합시다. 세포 내에 정상적으로 존재하면서 암의 생성을 막아주는, 소위 tumor suppressor gene이라고 알려진 p53이란 단백질을 만드는 유전자가 있습니다. 이 단백질이 기능을 못하면 tumor가 생성될 수 있습니다. 그러면 당연히 p53을 만드는 유전자에 문제가 생겨있을 수도 있겠지요. 그러므로 우리는 암세포에서 과연 p53 유전자에 돌연변이와 같은 문제가 생겨있는지를 조사하려고 합니다. (물론 이런 실험들은 1990년대를 주름잡던 논문들에 이미 등장해 있는 것이지요. p53은 90년대 초반에 이미 Nature 지에서 선정한 molecule of the year였거든요.)

 

p53은 tumor suppressor로도 알려 있지만, 사실 cell cycle regulator이자 transcription factor입니다. 또한 apoptosis를 조절하기도 하지요.

 

 

 

그러므로 우리는 여기에서 정상세포와 암세포의 p53 유전자의 일부를 각각 얻어내고, 이 유전자를 cloning한 후 염기서열을 확인하는 과정에서 p53의 mutation이 존재하는지를 보려고 합니다.

 

여기에서 언급하지는 않겠지만, 위에서 설명한 가설에서 정상적인 단백질에 해당하는 것이 p53이라면 비정상적인 단백질에 해당하는 것으로 human papilloma virus의 E6, E7 oncogene을 들 수가 있습니다. 이런 유전자를 조사하는 것도 의미가 있겠지요. 마찬가지로 90년대를 풍미했던 oncogene들입니다.

 

자, 그러면 실험 디자인을 이해하셨을 것으로 생각합니다.

우리는 human cervix cancer cell과 정상 세포에서 p53 gene의 일부를 cloning하여 염기서열을 비교하는 작업을 할 것입니다.